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| 艾滋病病原学诊断进展 |
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作者：99aids |
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来源：http;//www.99aids.com |
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日期：2005-6-10 |
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健康网讯:
北京市疾病预防控制中心 邢玉兰
艾滋病高度依赖病原学诊断的传染病，因为无论是在感染早期或发病期，还是
在较长的潜伏期，都只有通过病原学检验，找出其病原体——人免疫缺陷病毒（H
IV）存在的证据，才能做出HIV感染或艾滋病的诊断。HIV检验要求绝对准确可靠，
无论是假阳性还是假阴性都将造成十分严重的后果。因此，10多年来，艾滋病原学
诊断技术迅速发展，主要包括HIV病毒分离、HIV病毒载量测定、HIV核酸检测，以
及检测病毒抗原（p24抗原）和检测病毒特异性抗体。其中抗体检测方法是常规使
用的HIV病原学诊断方法，其他方法主要用于特殊情况（“窗口期”、婴儿诊断、
HIV抗体检测结果为不确定等—），或作为抗体检测方法的补充用作辅助诊断，或
作为判断预后和指导治疗用药的依据（病毒载量的测定），一般不用作常规诊断。
现将主要病原学诊断进展分述如下。
一、HIV抗体测定
检测抗-HIV抗体是艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制HIV传播和控制艾滋
病流行的重要手段。抗-HIV测定诊断要求准确、可靠，故必须经初筛试验和确认试
验2个步骤。当前采用的初筛方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒凝集
试验（PA）、斑点印迹（层析或渗滤）试验和免疫荧光试验（IFA）。确认试验主
要用免疫印迹试验（Western blot, WB）。
1．ELISA：检测抗-HIV的ELISA法是国际上应用最早、发展最快、至今在血源
筛查中普遍使用的检测技术。为了保证输血安全，试剂的敏感性不断提高，窗口期
显著缩短，使输血传播HIV的危险性大幅度下降。HIV经输血传播的危险从80年代的
较高水平降至近年的1/440 000~1/600000以下[1]。1985年美国研制成功第1代试剂
（用病毒裂解抗原包被的ELISA间接法），虽然敏感性、特异性均较低，但在防止
输血传播HIV上起到创始作用。为了避免细胞培养蛋白导致的非特异性反应，1990
年，用基因重组和成肽抗原研制成第2代试剂。次年国际上又研制成双抗菌素原夹
心法第3代试剂，灵敏度提高到99%以上，特异度>95%。第3代试剂不驻可检测抗-H
IV IgG，而且可检测早期出现的IgM抗体，并在1996年改进成含有“O”亚型的第3
代试剂。1998年，国际上已出现第4代试剂，在检测抗-HIV的同时也可检测p24抗原
，称为HIV抗原/抗体试剂。第4代试剂目前主要有3种，分别是Vironostika HIV Ⅱ
抗原/抗体、HIV Combi(Boehringer)和HIV DUO（Biomerieux）。正在我国注册的
第4代试剂是荷兰生产的Vironostika HIVⅡ抗原/抗体，其抗原组分为gp160/gp36
/NAT70，同时还包被了一个单克隆抗-p24抗体。由于试剂不断改进，使“窗口期”
逐渐缩短，第1代试剂“窗口期”约为3个月，第2代比第1代平均缩短20 d，第3代
比第2代缩短4~9 d[2]，第4代比第3代平均缩短4~7d。我国国产的ELISA试剂起步较
晚，近年来发展也较快，不少厂家已研制出第3代试剂。
尽管“窗口期”逐渐缩短，但95.0%HIV感染者产生抗-HIV是在感染后5.8个月
，故一般将“窗口期”定为6个月。
2．明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是一种快速的HIV血清抗检测方法。先将样品
稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保湿（一般为室温
）。由于操作简便，无需特殊仪器设备，很适合对少量标本的检测。当血清中有H
IV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒
在孔中的凝集情况判读结果。目前已研制出HIV-1和HIV-2抗原共同致敏感的PA试剂
（AFD HIV 1/2 PA）和HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（AERODLA-HIV-1/2）
。目前可用于HIV1/2的筛查，后者可用一区分HIV-1型和HIV-2型。
3.斑点印迹（或免疫层析/或渗滤）试验：一般采用硝酸纤维素膜作固相载体
，在载体下面有吸水衬垫可吸收加入的液体。将重组或多肽抗原包被在载体内，加
入待检血清，包被抗原和被检血清中抗体结合，用胶体金（或胶体硒）代替底物连
接在葡萄球菌蛋白A上，金标记蛋白A具有与人Ig结合的能力，因而可与被捕获的H
IV抗体结合。若样品中有3~10min出结果，特异性较好，敏感性约相当于中度敏感
的ELISA，对应急使用和农村偏远地区临床用血检测较为适宜，但不适于城市地区
的献血员筛查。在农村偏远地区临床用血也必须进行HIV检测。目前在国内批准注
册的有：Deter-min HIV1/2(ABBOTT)和Instant CHEK-HIV1+2(EY)2种金标（硒标）
快速诊断试剂。
4. 免疫荧光试验（IFA）：将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上，经固定后即为
试验用抗原片，待检血清中的抗-HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人I
g结合，在荧光显微镜下可见到含草绿色荧光的细胞和多核巨细胞（胞浆荧光）。
目前国内仅在少数有条件和实验室使用。
5. 其他初筛试验方式：唾液HIV检测，尿液HIV检测[3]，家庭用HIV其他快速
筛查试验（RST）等。
6.免疫印迹试验：主要用于确认试验。WB是将HIV病毒蛋白用十二烷基磺酸钠
-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再
把这些分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝
酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成
1：100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中
若含有抗-HIV抗体，就会与膜条上的带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，
即可使有反应的抗原-抗 体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果。
我国判定标准：（1）HIV抗体阳性：至少2有条膜带（即gp160/gp120/gp41）
和至少有1条膜带和p24（核心）带同时出现。（2）HIV抗体阴性：无HIV抗 体
特异性带出现。（3）HIV抗体可疑：出现HIV特异性抗 体带，但带型不足以确认阳
性者。世界各国（或机构）对免疫印迹试验的结果判定标准并不完全一致，美国传
染病中心的判定标准是：HIV-1阳性[任两有其中2个条带（p24、gp41、gp120/160
）]，HIV-2无阳性; 而WHO的判定标准是：HIV-1阳性（不管有无核心带或酶带，但
有2条膜带），HIV-2阳性（不管有无核心带或酶带，但有2条膜带即为阳性）。
二、HIV核酸检测
应用聚合酶链反应(PCR)技术检测外周血淋巴细胞中HIV的前病毒DNA序列，或
用逆转录-PCR（RT-PCR）法检测血浆中游离HIV的RNA。主要用于以下情况：（1）
早期诊断围产期感染：（2）对HIV抗体免疫印迹试验的进一步做出诊断；（3）在
HIV抗 体未产生之前（“窗口期”）辅助诊断急性原发感染；为阻断“窗口期”H
IV经血传播，有些发达国家已将HIV RNA 的RT-PCR检测纳入血源检测；（4）区别
HIV-1和HIV-2感染；（5）确定人群中HIV的变异；（6）监测临床药物治疗反应；
（7）检测病毒的耐药性突变。
三、病毒载量（VL）测定
病毒载量测定是对感染或病人体内游离病毒核酸RNA含量的定量测定。通常使
用血浆作为检测样品，根据不同要求改进的RNA提取技术使该试验也可使用多种体
液和组织。目前使用的病毒载量测定技术主要有3种：RT-PCR、分支DNA信号扩大系
统（bDNA）和核酸序列扩增系统（NASBA）。3种技术均由核酸提取、扩增或信号放
大、定量检测3部分组成。
由于该方法敏感性和特异性高，在对感染早期及特殊免疫反应个体检测中具有
重要意义，对判定临床进展情况、估计预后、疗效观察很有效，是制订和调整治疗
方案的主要依据。血浆HIV RNA水平测定的意义为：（1）有急性HIV感染表现者：
当HIV抗 体试验阴性或不确定时有助于确定诊断；（2）初诊断为HIV感染者：测定
基本的病毒负荷量，以确定开始或推迟治疗；（3）未接受治疗者：第3~4个月测定
1次，以观察病毒负荷变化，选择开始治疗的时机；（4）首次接受抗逆转录病毒治
疗者：治疗4~8周后药效评估，决定续用或调整方案；（5）接受抗逆转录病毒治疗
3~4个月者：观察治疗的最大效果，决定续用或调整方案；（6）长期接受抗转录病
毒治疗者：每3~4个月测定1次，以观察疗效的特久性，决定续用或调整方案；（7
）CD4+细胞显著下降或有其他临床改变：确定与病毒负荷是否有关，决定开始治疗
、续用或调整方案。
HIV RNA水平测定应避免在病人急性感染期（如细菌性肺炎、结核感染、卡氏
肺孢子虫肺炎等）和免疫接种期进行，因此时（2-4周）血浆HIV RNA可升高。血浆
HIV RNA的测定应在同一实验室同一方法进行，并在决定开始治疗或调整方案时重
复验证。若本测定用于诊断HIV感染，则需有其他标准的方法验证。
四、P24抗原测定
通常采用夹心法EIA，即将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底，当加入待
测血清后，若血清中含有p24抗原则与包被抗体形成抗原-抗 体复合物，再加入酶
（HRP）标记的HIV抗体，在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物显色后，在酶标
仪上读结果。
近年来为了提高检测血清中p24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物解离（IC
D）后再进行测定，发展了ICD p24抗原测定试剂，用于HIV p24抗 原测定。
五、HIV细胞培养（病毒分离）
常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测
定培养液HIVp24抗原/RT，进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。
细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性[4]。但其敏感性
不如血清学或PCR，因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。细胞
培养方法的最大好处是能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不确定
的疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。毒株可供药物筛选，耐药性及其生物
学特性等研究。用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和英国数
抑制药物浓度（IC50），用于抗病毒药物测定。本法一般不同于常规诊断。
摘自《中华检验医学杂志》 |
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