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| 微量全血培养在HIV感染诊断中的应用 |
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作者：99aids |
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来源：http;//www.99aids.com |
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日期：2005-6-10 |
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近年来艾滋病已在全国范围内迅速蔓延开来，其主要传播途径为经静脉共用注射器吸毒为主的经血传播和性接触传播，1995年在云南省首次发现经母婴垂直传播的小儿HIV感染者［1］。随着育龄妇女HIV感染者的增多，通过母婴途径传播的儿童HIV感染率上升。由于母体被动IgG抗体存在的缘故，不能使用血清学诊断方法对2岁内的小儿进行HIV抗体检测，此外，用经典方法抽取大量的血液进行HIV病毒分离确认儿童感染有一定的难度。因此开展微量全血HIV分离培养技术用于小儿HIV可疑感染者的快速早期诊断以及病原学研究等势在必行，我们对微量全血HIV分离培养技术进行了研究，现将结果报告如下。
1 研究对象及方法
1.1 研究对象 经本室确认的4例HIV抗体阳性者，男女各2名，年龄在23～60岁。根据我国HIV/AIDS诊断标准（国家标准1995），其中1例为艾滋病病人，其余3例为无症状HIV感染者。
1.2 标本采集 无菌操作抽取静脉血15 ml，注入含肝素抗凝剂的无菌试管中（其肝素钠含量为10～20 IU/ml）。血样在取血6 h内进行共培养。
1.3 正常人淋巴细胞（PBMC）的制备 按常规抽取正常人（艾滋病抗体检测阴性，无其它传染病者）静脉血，肝素抗凝，1000 r/min离心，吸出血浆，血细胞用Hanks液稀释至原体积的3倍，用Ficoll-Hypaque液分离并收集PBMC，Hanks液洗2次，然后悬浮在RPMI 1640刺激培养基中（其中每毫升培养液中含有10%热灭活胎牛血清、青霉素100 IU、链霉素100 μg、IL-2 100 IU、谷氨酰胺2 mmol、PHA-P 5 μg 及Polybrene 5 μg），调整细胞数为2×106/ml。在5%CO2、37℃温箱中培养48～72 h，即为活化的PBMC，或与病人全血进行同时刺激共培养。
1.4 常规共培养 用上述方法分离出病人的PBMC，1×107感染者PBMC与5×106活化了的健康供者PBMC共同培养在15 ml的淋巴细胞生长液中（其中每毫升生长液中含有10%热灭活胎牛血清、青霉素100 IU、链霉素100 μg、IL-2 100单位、谷氨酰胺2 mmol、神经氨酸酶0.003 IU及Polybrene 5 μg），每隔3～4 d换液1次。其中在第7、14及21天还需补充5×106活化的供者PBMC，共培养28 d。每次所移去的上清液均须保存，以便检测P24抗原。
1.5 微量全血培养
方法1： 将含有肝素抗凝剂的受检者全血以终点稀释在24孔板上（每孔量分别为1000， 500， 250， 125， 62.5，10 μl），加入激活了的正常人的PBMC 106进行复孔培养，每孔加入淋巴细胞生长液，使总量为2 ml，置5%CO2、37℃温箱中培养。
方法2： 将含有肝素抗凝剂的受检者全血以终点稀释在24孔板上（每孔量分别为1000，500，250，125，62.5，10 μl），加入新鲜的未经PHA-P激活的正常人PBMC 1×106进行复孔培养，每孔加入RPMI-1640刺激培养基，使总量为2 ml。刺激培养3 d后，复孔中1孔收集离心，弃上清，沉淀物用淋巴细胞生长液悬浮，培养在另一24孔板中（即其中不含PHA-P），另1孔不收集离心，按常规用淋巴细胞生长液换液（即其中含有少量的PHA-P）。
以上两种方法的全血培养每隔3～4 d移去1 ml培养上清液，随之补充1 ml新鲜的生长液，其中在第7、14、21天还需补充106新鲜的激活了的正常人PBMC，共培养28 d。每次所移去的培养液均须保留以便检测其P24抗原的含量。
1.6 P24抗原检测及结果判断 P24抗原试剂盒为Organon Teknika公司生产的Vironostika HIV-1 Antigen Microelisa System试剂盒，批号99101806；酶标仪Bio-Rad 550型。操作步骤严格按说明书进行。每3 d进行一次P24抗原检测。
阳性结果判断：在整个培养过程中首次出现阳性的样本，其P24抗原值必须大于30 pg/ml，若紧接着的下一个取样标本也是阳性而且其P24抗原值比前一个样本值高4倍以上，则可以肯定受检者的血液标本为艾滋病病毒阳性。培养过程中，连续两次取样（即间隔3～4 d）均呈现P24抗原阳性，且OD值大于3.0，即可终止培养。若培养的全过程至第28天均为阴性，则在第28天或32天终止培养。
2 结果
2.1 不同培养方法的HIV分离情况 4名受检者中有3例全血标本均分离出HIV-1。有1例阳性标本不管是常规培养还是全血培养均未分离成功。在常规培养中，已出现AIDS症状的病人的血样标本在共培养第3天时已出现阳性，第7天时P24抗原测量值已超过3.0，而其他未出现症状的HIV携带者血样标本在共培养第7天时才出现阳性，且其OD值明显低于AIDS病人。但是这种现象在微量全血培养中未能观察到，AIDS病人和HIV携带者血样标本在共培养第7天时几乎同时出现阳性，且OD值无明显差异。全血培养中，方法1与方法2血样培养首次出现阳性的时间没有明显差异，但是方法2中同一时间内不含PHA-P培养分离出的病毒滴度均比含PHA-P的稍高些。
2.2 全血培养中HIV复制的动力学 微量全血培养中出现阳性的时间顺序是10 μl＞62.5 μl＞125 μl＞250 μl＞500 μl＞1000 μl。在培养第7天时，10 μl孔、62.5 μl孔、125 μl孔均出现阳性，但P24抗原测量值有差异，其中10 μl孔＞62.5 μl孔＞125 μl孔。随着培养时间的增加，其它孔也相应陆续出现阳性，直到第21天，1000 μl孔才出现阳性，且滴度很低。每孔滴度随培养时间的延长而递增。
3 讨论
HIV分离培养是当今HIV垂直感染诊断的依据，早期虽然已有常规培养方法来检测HIV，但这些技术依赖于血液成份的分离，花时间并难以从儿童得到有效血量。血清学检测在＜24月龄的小儿中有一定的局限性，其主要原因是因为24个月内的婴儿体内可能仍存有母体的HIV抗体，而ELISA和WB的方法不能确定抗HIV抗体是来源于母亲还是婴儿自身产生。为此，Bayliss等人首次用微量全血培养法从HIV/AIDS感染者血液中分离出HIV病毒。此外，国外其他学者在微量血培养方面也做了不同程度的研究。微量全血培养的优点在于省去分离PBMC的需要，以及培养能很快地建立，且只要少量体积的全血，这些特征使它真正地适合于小儿艾滋病感染诊断及管理。
HIV分离率除了与实验方法有关外，还与临床症状、病毒学、免疫学等方面有关。外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞数对HIV的分离率有一定的影响，而与是否接受抗病毒治疗无关。本实验中有一株未能分离出HIV，可能与此有关，其原因有待于进一步研究。本研究用两种全血培养方法来研究其可行性，即一种是用HIV/AIDS感染者全血和经PHA-P激活了的供者PBMC共培养，另一种是用HIV/AIDS感染者全血和未经PHA-P激活的供者PBMC同时刺激共培养。研究发现用后一种培养方法也能够从全血中分离出HIV病毒，而且在此研究之前我们在用患者PBMC与供者PBMC同时刺激共培养中也对此作过相应的研究，发现常规培养与同时刺激共培养两者结果无很大差异。因此，在时间仓促未能及时地激活供者PBMC情况下也可以用同时刺激共培养法来分离病毒。但是PHA-P除了可以活化HIV LTR引导基因的表达外，还有灭活细胞外HIV的作用，因此，在同时刺激共培养中加PHA-P刺激3 d后，应及时去除PHA-P，这可能有利于分离到病毒。
实验发现，越大体积量的全血培养其出现阳性的时间越迟，滴度也比少量血培养来得低。其中10～125 μl的全血量培养最早分离出病毒，而且滴度也高。一般在出现阳性后4 d内其OD值就大于3.0。这和Fiore 等所述的50 μl甚至少到5 μl的全血量就足以分离出HIV［6］的结论在一定程度上相符合。
微量全血方法的建立对于血清阳转之前标本的检测和对阳性母亲所生婴儿的HIV感染的调查，及研究哪种基因型更易通过母婴垂直传播等方面提供了一种行之有效的实验方法,今后可用于常规研究。
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